干细胞成软骨诱导分化培养基

人间充质干细胞成软骨诱导分化培养基说明书

【产品名称】 人间充质干细胞成软骨诱导分化培养基

【包装规格】200mL/Kit

【产品参数】

◆pH值：7.2 - 7.4

◆内毒素：≤1 EU/mL

◆渗透压：280 - 320 mOsm/kg·H2O

◆生物安全：细菌、真菌、支原体检测阴性

◆质量检测：成软骨诱导分化能力测试合格

【产品简介】

人间充质干细胞成软骨诱导分化试剂盒具有高效成软骨定向分化能力，诱导分化时间短，诱导分化效率高，可用于多种来源的人间充质干细胞成软骨诱导分化。

【产品组成】

            产品信息                            货号                规格              保存条件              有效期

成软骨诱导分化基础培养基            D-Y03A            175mL            2-8°C，避光            1年

成软骨诱导分化添加物                  D-Y03B              25mL            -20°C，避光            1年

阿利新蓝染色液                            D-Y03C              10mL           2-8°C，避光             1年

*将基础培养基和添加物混匀配制成成软骨诱导分化完全培养基，置于2-8°C中避光保存，2周内使用完。

【使用方法1】

1 准备间充质干细胞

取对数生长期的间充质干细胞， 将2.5×105cells/ml，1mL细胞转移至15mL离心管中，300xg离心5min，吸弃上清，加入1mL/管间充质干细胞扩增完全培养基重悬混匀，450xg离心10min，轻轻拧松离心管盖，于37℃，5% CO2培养箱中孵育24h。

2 成软骨诱导分化

吸弃离心管中的间充质干细胞扩增完全培养基，沿管壁缓缓加入2mL/管成软骨诱导分化完全培养基，置于 37℃，5% CO2 培养箱中培养，每3天换液一次，每次2mL/管，持续诱导，直至管内形成1.5-2mm的软骨球，准备切片染色。

3 染色鉴定

3.1 固定、脱水、透明，吸弃成软骨诱导分化完全培养基，2mL/管加入PBS轻柔清洗2次，吸弃PBS，2mL/管加入4%中性多聚甲醛固定液，室温固定10min，用乙醇梯度脱水、二甲苯透明后行组织冰冻切片。

3.2 冰冻切片，用包埋剂处理诱导成型的软骨球，调节厚度为10µm进行冰冻切片（包埋过的样品可在-80℃保存2个月）。

3.3 清洗样本，将切片浸泡在PBS中，清洗2次，每次摇床晃洗10min。

3.4 染色，充分晾干水分后，在每张切片上滴加50µL阿利新蓝染液，将切片置于湿盒中，放入37℃干燥箱中染色30min，用流水缓慢滴洗切片3min，充分晾干水分。

4 成软骨诱导分化能力评估

将切片置于显微镜下观察成软骨染色效果，进行图像采集和成软骨诱导分化能力评估。成软骨诱导分化成功时，软骨组织中的酸性粘多糖与阿利新蓝染料发生显色反应后呈现蓝色。

*间充质干细胞的成软骨分化水平因细胞来源，培养条件、细胞代次、细胞状态和分化时间等因素而异。

【使用方法2】

1 准备间充质干细胞

取对数生长期的间充质干细胞， 按 2.0×104cells/cm2 的细胞密度接种至6孔板中（*建议预先用0.1%明胶对6孔板培养底面进行包被），于 37℃，5% CO2 培养箱中培养至汇合度达 70%-80% 左右，吸弃上清，加入成软骨诱导分化完全培养基。

2 成软骨诱导分化

将加有成软骨诱导分化完全培养基的间充质干细胞置于 37℃，5% CO2 培养箱中培养，每3天换液一次，每次2mL/孔，连续诱导14-28天，直至形成明显的软骨球，准备染色。

3 染色鉴定

3.1 固定，吸弃成软骨诱导分化完全培养基，PBS轻柔清洗2次，吸弃PBS后取适量 4%中性多聚甲醛固定液覆盖6孔板底面，室温固定 30min，吸弃固定液后用ddH2O清洗3次。

3.2 染色，加入适量阿利新蓝染液，室温避光染色15-30min，吸弃染色液后用ddH2O清洗3-5次，再加入适量ddH2O浸润避免细胞干燥。

4 成软骨诱导分化能力评估

将切片置于显微镜下观察成软骨染色效果，进行图像采集和成软骨诱导分化能力评估。成软骨诱导分化成功时，软骨组织中的酸性粘多糖与阿利新蓝染料发生显色反应后呈现蓝色。

*间充质干细胞的成软骨分化水平因细胞来源，培养条件、细胞代次、细胞状态和分化时间等因素而异。

【注意事项】

◆收货后尽快放入保存温度。

◆本产品经过滤除菌，使用时应注意无菌操作，避免污染。

◆为保持本产品的最佳使用效果，请勿反复冻融。

◆本产品可用于科研,不可用于临床治疗等领域。