胃癌类器官培养试剂盒

胃癌类器官培养试剂盒   货号： PRS-GCOK-Ⅱ

胃癌类器官试剂盒是一款用于人源胃癌类器官原代提取、体外形成和扩增的试剂盒，包含从胃癌组织处理，到类器官构建、扩增及冻存的全套试剂。

使用说明　　收到产品后请于以下推荐温度储存：

使用说明

注意:以下操作均需在无菌环境中进行。

实验前准备:

(1)提前1-2小时从-20°C冰箱取出所需体积的基质胶(产品目录号:PRS-LM PRECEDO )，于冰上融化。 

(2)提前30分钟从4°C冰箱取出胃癌类器官培养基(产品目录号:PRS-GCM-3D，PRECEDO )，使其平衡至室温。

(3)将15 mL无菌离心管、无菌刀片、无菌枪头等表面消毒后放入超净工作台中紫外照射30分钟。 (4)配置含1%BSA(产品目录号:V900933，Sigma)的DMEM/F12培养基、含10%血清(产品目录号:10091148，Gibco)的DMEM培养基，冰上预冷备用。

(4)配置含1% BSA(产品目录号:V900933，Sigma)的DMEM/F12冰上预冷备用。

肿瘤组织样本的消化:

(1)在60 mm培养皿中加入5 mL试剂盒内所含的组织清洗液(产品目录号: PRS-TCR-I，PRECEDO )， 将样本倒入其中，并切成3 - 4大块，用培养皿中液体反复吹洗样本后吸出上清液。

(2)将60mm培养皿置于冰上。用无菌手术刀片将样本切碎为糊状，加入7mL组织清洗液(产品目录号: PRS-TCR-I，PRECEDO )于培养皿中，收集组织碎片至15mL离心管，1500rpm，室温离心5min，弃上清。 (此步骤依据样本大小重复1-2次)。

(3)根据原肿瘤组织块大小加入适当体积(消化液体积需是原肿瘤组织体积的25-50倍)的本试剂盒内提供的组织 消化酶II(产品目录号:PRS-TDE-II，PRECEDO )，并置于37°C恒温摇床中进行振荡消化，200-250 rpm，消化30-40 min(不同病人来源的肿瘤样本，因其肿瘤亚型及个体化差异，消化所需时间会有所不同)。

注意:在此操作过程中须仔细监测消化过程，因为过度消化会显著降低类器官的形成效率。当组织块出现絮状拉 丝或组织块大小较原始体积减少一半时即可终止消化。

(4)将所得的细胞悬液用100μm滤网过筛，用枪头研磨组织，使组织尽量通过筛网。1500rpm，室温离心5分 钟，弃上清;

(5)若红细胞较多，添加3mL红细胞裂解液，冰上裂解5-10min。1500rpm，离心5分钟，弃上清，用DMEM (含10% FBS)重悬细胞沉淀待用。

胃癌类器官的培养(以24孔板为例)

(1)将获取的胃癌原代细胞悬液进行细胞计数，根据计数结果选择所需要接种的孔数(通常保证每孔至少含有 2×105个细胞)。

(2)1500rpm，离心5 min，弃上清(此步骤可重复一次，以确保培养基完全去除)。将细胞沉淀置于冰上。

(3)从 37 °C 培养箱中取出 24孔板。用 DMEM/F12(含1% BSA)预冷200μL枪头。按照30μL/孔基质胶的 体积，将适量体积基质胶加入细胞沉淀，并在冰上小心吹打混匀(注意:为了避免气泡产生，在加入基质胶的时候可 按照损耗量多加入一些)。

(4)按照30μL/孔基质胶的体积，将细胞沉淀与基质胶的混合悬液轻轻滴在已提前预热好的24孔板中央，使之形 成圆顶状胶滴。缓慢将细胞培养板移至培养箱，孵育30min。

(5)待基质胶凝固后，沿24孔板内壁缓慢加入预先恢复至室温的胃癌类器官培养基(产品目录号: PRS-GCM-3D，PRECEDO )，置于5 % CO2、37 °C培养箱中培养。

(6)镜下观察类器官形成情况，每2-3天更换一次培养基。

胃癌类器官的传代(以24孔板为例，一般1 : 2传代)

(1)当培养板中类器官平均直径大于100μm，类器官细胞过多、生长超出胶体产生贴壁现象时需要传代。

(2)按照“实验前准备”部分准备好所需试剂及耗材，准备好类器官回收试剂(产品目录号:354253，Corn- ing)和类器官解离试剂(产品目录号:PRS-ODR PRECEDO );

(3)将培养板中培养基吸入15mL离心管，加入1mL预冷的DMEM/F12培养基吹打底部胶体(轻柔，多次，把胶 吹散)，将吹散的胶体转入离心管。1500rpm，室温离心5min，弃上清。

(4)加入预冷的类器官回收试剂(产品目录号:354253，Corning)，一般1孔类器官需加入500μL，以此类 推。轻轻重悬细胞沉淀，冰浴30min后，300g，4 °C离心5min，弃上清;

(5)除胶完成后，1500rpm，4°C离心5min，弃上清，加入4mL类器官解离试剂(产品目录号:PRS-ODR，PRECEDO )，摇床转速250rpm，消化7-10min。

(6)摇床振荡完毕后，加入4mL DMEM(含10% FBS)，300g，离心5min，吸弃上清，将细胞沉淀置于冰上。 

(7)按照“胃癌类器官培养”步骤的3-6继续进行类器官的接种和培养。

胃癌类器官的冻存

(1)重复“胃癌类器官的传代”的步骤1-5;

(2)加入适量的类器官冻存液(产品目录号:PRS-OCR，PRECEDO )于离心管中，轻柔混匀，制成混合液。

(3)将离心管中的混合液按照至少1×106/管细胞数转入冻存管，建议每管体积1.5mL，在冻存管上作好标记。

(4)将细胞冻存管放入梯度冻存盒中，-80°C超低温冰箱中保存。注意:-80°C不可保存超过1周，若需长期保存，需移至液氮罐中。

注意事项

1、本产品在使用前需平衡至室温。

2、使用产品时应注意无菌操作，避免污染。

3、本品含抗生素，如无特殊需要，可直接使用，无需任何添加。 

4、为保持本产品的最佳使用效果，不宜将其过夜放置于室温或较高的温度环境中。

5、为达到预期效果，请于保质期内使用本产品。 

6、建议使用肿瘤术中样本，目的肿瘤细胞比例越高(至少>50%)，培养成功率越高。不推荐用于少量样本(如穿刺或者循环肿瘤细胞)的 培养。

7、本产品仅用于科研用途，不能用于体外诊断。

PS 本产品由ZWK、PRECEDO 联合提供技术支持。