乳腺癌类器官试剂盒

乳腺癌类器官培养试剂盒    货号： PRS-BCOK

乳腺癌类器官试剂盒是一款用于人源乳腺癌类器官原代提取、体外形成和扩增的试剂盒，包含从乳腺癌组织处理，到类器官构建、扩增及冻存的全套试剂。

使用说明

实验前准备:

(1)提前将24孔细胞培养板置于37 °C的培养箱中预热2h。

(2)将15 mL无菌离心管、1.5 mLEP管、移液器、移液管、无菌枪头等表面消毒后放入超净工作台中紫外照射30 min。

(3)提前30min从4°C冰箱取出试剂盒内所含的乳腺癌类器官培养基(产品目录号:PRS-BCM-3D，合肥中科普 瑞昇)平衡至室温。

(4)提前从-20°C冰箱取出试剂盒内基质胶(产品目录号:PRS-LM，PRECEDO )冰上融化。 (5)配置含10% FBS(产品目录号:10091148，Gibco)的DMEM备用。

(6)配置含1% BSA(产品目录号:V900933，Sigma)的DMEM/F12冰上预冷备用。

肿瘤组织样本的消化:

(1)在60mm培养皿中，用5-6 mL 试剂盒内所含的组织清洗液(产品目录号:PRS-TCR-1，PRECEDO )冲洗组织样本，吸弃上清液。再加入10mL组织清洗液至培养皿中。

(2)将培养皿至于冰上，利用手术剪或手术刀将乳腺肿瘤组织切割成体积约为1~3mm2的碎片。产品名称产品组成规格数量储存温度及有效期乳腺癌类器官培养基PRS-BCM-3D60mL1-20°C 1年;2-8°C 1个月基质胶PRS-LM1.5mL1-20°C 2年组织清洗液PRS-TCR-I50mL1-20°C 1年;2-8°C 6个月组织消化酶IIPRS-TDE-II30mL1-20°C 1年类器官解离消化试剂PRS-ODR20mL1-20°C 1年;2-8°C 1个月类器官冻存液PRS-OCR20mL1-20°C 1年;2-8°C 1个月1(3)将切碎后的组织转移至15mL离心管中，并用2-3mL组织清洗液冲洗培养皿，将冲洗液收集至同一离心管中。 300g，5min离心，吸弃上清。

(4)根据原组织块大小加入适当体积的(消化液体积需是原肿瘤组织体积的25-50倍)本试剂盒内提供的组织消化 酶II(产品目录号:PRS-TDE-II，PRECEDO )，置于37°C恒温摇床中进行组织消化，摇床转速200-250 rpm，一般消化40-60min(不同病人来源的乳腺肿瘤的样本，因其肿瘤亚型及个体化差异，消化所需时间会有所不 同)。

注意:在此操作过程中须仔细监测消化过程，因为过度消化会显著降低类器官的形成效率。当组织块出现絮状拉 丝或组织块大小较原始体积减少三分之二时即可终止消化。

(5)在消化完成的组织悬液中加入5-6 mL DMEM(含10% FBS)以终止消化，300g，5min离心，弃上清。

未消化完全的剩余组织可再次加入组织消化酶II进行消化，重复步骤(4-5)。所获得的消化悬液完成中止消化步 骤后用100μm细胞筛网过滤，300g，5min离心，弃上清。若进行了二次消化，则合并两次消化后过筛离心得到的细 胞沉淀待用。

乳腺癌类器官的培养(以24孔板为例)

(1)用DMEM(含10% FBS)重悬细胞沉淀，对细胞悬液进行细胞计数。按每孔2~5×105个细胞密度计算需接 种的孔数。

(2)细胞沉淀300g，5min离心，弃上清(此步骤可重复一次，以确保培养基完全去除)，小心吸弃上清，将细胞 沉淀置于冰上。

(3)从 37 °C 培养箱中取出 24孔板。用DMEM/F12(含1% BSA)预冷200μL枪头。按照40μL/孔基质胶的 体积，将适量体积基质胶加入细胞沉淀，并在冰上小心吹打混匀(注意:为了避免气泡产生，在加入基质胶的时候可 按照损耗量多加入一些)。

(4)按照40μL/孔基质胶的体积，将细胞沉淀与基质胶的混合悬液轻轻滴在已提前预热好的24孔板中央，使之形 成圆顶状胶滴。缓慢将细胞培养板移至培养箱，孵育30min。

(5)待基质胶完全凝固后，按1mL/孔沿24孔板内壁缓慢加入预先恢复至室温的乳腺癌类器官培养基(产品目录 号:PRS-BCM-3D，PRECEDO )，并将培养板置于37 °C，5% CO2条件下静置培养。

镜下观察类器官形成情况，每2~3天更换一次培养基。

乳腺癌类器官的传代(以24孔板为例，一般1 : 2传代)

(1)当培养板中类器官平均直径大于100μm，类器官生长超出胶体产生贴壁现象或培养基变黄时需要进行传代或 冻存;

(2)按照“实验前准备”部分准备好所需试剂及耗材，准备好细胞消化酶(产品目录号:12605028，Gibco)、 类器官回收试剂(产品目录号:354253，Corning)和类器官解离试剂(产品目录号:PRS-ODR，PRECEDO );

(3)将培养板中培养基吸入15mL离心管，加入1mL预冷的DMEM/F12培养基吹打底部胶体(轻柔，多次地将胶 体吹散)，将吹散的胶体转入离心管，然后每孔加入500 μL细胞消化酶(产品目录号:12605028，Gibco)，放入 培养箱中消化15min，一般不超过15min;

(4)消化完成后取出培养板，将消化后的细胞悬液轻轻吹离培养板，转移至15mL离心管，加入5 mLDMEM(含 10%FBS)终止消化，300g，离心5min;2(5)小心吸弃上清，注意不要将管底部半透明的胶体吸出;

(6)加入适量体积类器官回收试剂(产品目录号:354253，Corning)，一般1孔类器官需加入500μL类器官回 收试剂，以此类推。轻轻重悬细胞沉淀，冰浴30min后，300g，4 °C离心5min，弃上清;

(7)加入4mL类器官解离试剂(产品目录号:PRS-ODR，PRECEDO )，摇床转速180-220rpm，消化 8-10min。

(8)摇床振荡完毕后，加入4mL DMEM(含10% FBS)，300g，离心5min，吸弃上清，将细胞沉淀置于冰上。 按照“乳腺癌类器官培养”步骤的2-5继续进行类器官的接种和培养。

肝癌类器官的冻存

(1)重复“乳腺癌类器官传代”的步骤1-8;

(2)加入适量的类器官冻存液(产品目录号:PRS-OCR，PRECEDO )于离心管中，轻柔混匀，制成细胞 混悬液。

(3)将离心管中的混合液按照至少1×106/管细胞数转入冻存管，建议每管体积1.5mL，在冻存管上作好标记。

(4)将细胞冻存管放入梯度冻存盒中，-80°C超低温冰箱中保存。注意:-80°C不可保存超过1周，若需长期保 存，需移至液氮罐中。

注意事项

1、本产品在使用前需平衡至室温。

2、使用产品时应注意无菌操作，避免污染。

3、为保持本产品的最佳使用效果，不宜将其过夜放置于室温或较高的温度环境中。 

4、请于保质期内使用本产品，超出保质期，需停止使用。 

5、样本需为肿瘤术中样本，且肿瘤细胞比例越高(至少>50%)，培养成功率越高。不推荐用于少量样本(如循环肿瘤细胞)进行培养。 

6、本产品仅用于科研用途，不能用于体外诊断。

PS 本产品由ZWK、PRECEDO 联合提供技术支持。