肝癌类器官培养试剂盒

肝癌类器官培养试剂盒    货号： PRS-HCOK

肝癌类器官试剂盒是一款用于人源肝癌类器官原代提取、体外形成和扩增的试剂盒，包含从肝癌组织处理，到类器官构建、扩增及冻存的全套试剂。

使用说明

实验前准备:

(1)提前1 - 2小时从-20 °C冰箱取出所需体积的基质胶(产品目录号:PRS-LM ，PRECEDO )，于冰上融化。

(2)提前30分钟从4°C冰箱取出肝癌类器官培养基(产品目录号:PRS-HCM-3D，PRECEDO )，使其平 衡至室温。

(3)将15 mL无菌离心管、无菌刀片、无菌枪头等表面消毒后放入超净工作台中紫外照射30分钟。

(4)配置含1 % BSA(产品目录号:V900933，Sigma)的DMEM/F12培养基、含10 %血清(产品目录号: 10091148，Gibco)的DMEM培养基，冰上预冷备用。

肿瘤组织样本的消化:

(1)提前1 - 2小时从-20 °C冰箱取出所需体积的基质胶(产品目录号:PRS-LM ，PRECEDO )，于冰上融化。

(2)提前30分钟从4 °C冰箱取出肝癌类器官培养基(产品目录号:PRS-HCM-3D，PRECEDO )，使其平 衡至室温。

(3)将15 mL无菌离心管、无菌刀片、无菌枪头等表面消毒后放入超净工作台中紫外照射30分钟。

(4)根据原组织块大小加入适当体积的(消化液体积需是原肿瘤组织体积的25-50倍)肿瘤组织消化酶II(产品目 录号:PRS-TDE-II;PRECEDO )置于37°C恒温摇床中进行组织消化(不同病人来源的肝癌样本，因其肿瘤 亚型及个体化差异，其消化所需时间可能会有所不同)，200-220 rpm，一般消化20-60 min。

注意:在此操作过程中须仔细监测消化过程，因为过度消化可能会显著降低类器官形成效率。组织块出现絮状拉丝 或组织块大小较原始体积减少一半时即可中止消化。

(5)在消化完成的组织悬液中加入5-6 mL DMEM(含10%FBS)以终止消化，300 g，5 min离心，弃上清。

(6)所获得消化悬液中止消化后用100μm筛网过滤，未消化完全组织可加入肿瘤组织消化酶II(产品目录号: PRS-TDE-II;PRECEDO )再次消化，即重复步骤4-5，将两次消化后得到的细胞沉淀合并。

(7)若沉淀红细胞较多，再添加5-10 mL红细胞裂解液，冰上放置5-10 min，300 g，离心5 min，弃上清。

肠癌类器官的培养(以24孔板为例)

(1)加入1 mL肝癌类器官培养基重悬细胞，对细胞悬液进行细胞计数。取10 μL细胞悬液与10 μL台盼蓝混匀， 选取三个不同视野计数观察细胞活率和细胞密度;

(2)按1×105/孔细胞密度计算接种的多孔板孔数，300 g，5 min离心沉淀，弃上清(此步骤可重复一次，以确保 培养基完全去除);将细胞沉淀置于冰上。

(3)用冰的1% BSA(产品目录号:V900933;Sigma)吹打润洗枪头;按照每孔加基质胶20 μL比例，根据 1×105/孔细胞密度用适量基质胶(冰上放置，防止凝固)重悬细胞，注意不能产生气泡;

(4)将基质胶与细胞的混悬液滴进24孔板中，再用枪头将液滴轻轻在孔的中央摊开，注意不要让胶滴边缘接触到孔 壁。将细胞培养板倒置于培养箱中孵育30 min;

(5)待基质胶完全凝固后，沿24孔壁按1 mL/孔缓慢加入预先恢复至室温的肝癌类器官培养基(产品目录号: PRS-HCM-3D;PRECEDO )，并将培养板置于37 °C，5% CO2条件下静置培养;

(6)镜下观察类器官形成情况;粒径大于50 μm即认为类器官已经形成，每2-3天更换一次培养基。

肝癌类器官的传代(以24孔板为例，一般1 : 2传代)

(1)当培养板中类器官平均直径大于100 μm，类器官细胞过多、生长超出胶体产生贴壁现象时需要传代。

(2)按照“实验前准备”部分准备好所需试剂及耗材，并准备类器官回收试剂(产品目录号:354253，Corn- ing)和类器官解离试剂(产品目录号:PRS-ODR，PRECEDO );

(3)将培养板中培养基吸入15 mL离心管，每孔加入1 mL预冷的DMEM/F12培养基吹打底部胶体(轻柔，多次， 把胶吹散)，将吹散的胶体转入离心管。1500 rpm，室温离心5 min，弃上清。

(4)加入提前预冷的类器官回收试剂(产品目录号:354253，Corning)一般1孔类器官需加入500 μL，以此类 推。轻轻重悬细胞沉淀，冰浴30 min后，300 g，4 °C离心5 min，弃上清;

(5)除胶完成后，1500 rpm，4°C离心5 min，弃上清，加入4 mL类器官解离试剂(产品目录号:PRS-ODR， PRECEDO )，摇床转速250 rpm，消化7-10 min。

(6)摇床振荡完毕后，加入4 mL DMEM(含10% FBS)，300 g，离心5 min，吸弃上清，将细胞沉淀置于冰 上。

(7)按照“肝癌类器官培养”步骤的3-6继续进行类器官的接种和培养。

2肝癌类器官的冻存

(1)重复“肝癌类器官的传代”的步骤1 - 6;

(2)加入适量的类器官冻存液(产品目录号:PRS-OCR，PRECEDO 昇)于离心管中，轻柔混匀，制成混合 液。

(3)将离心管中的混合液按照至少1×106/管细胞数转入冻存管，建议每管体积1.5 mL，在冻存管上作好标记。

(4)将细胞冻存管放入梯度冻存盒中，-80 °C超低温冰箱中保存。注意:-80 °C不可保存超过1周，若需长期保 存，需移至液氮罐中。

注意事项

1、本产品在使用前需平衡至室温。

2、使用产品时应注意无菌操作，避免污染。

3、本品含抗生素，如无特殊需要，可直接使用，无需任何添加。 3、为保持本产品的最佳使用效果，不宜将其过夜放置于室温或较高的温度环境中。

4、为达到预期效果，请于保质期内使用本产品。 

5、建议使用肿瘤术中样本，目的肿瘤细胞比例越高(至少>50%)，培养成功率越高。不推荐用于少量样本(如穿刺或者循环肿瘤细胞)的培养。

6、本产品仅用于科研用途，不能用于体外诊断。

PS： 本产品由ZWK、PRECEDO 联合提供技术支持。