肺癌类器官培养试剂盒

肺癌类器官培养试剂盒    货号： PRS-LCOK

肺癌类器官试剂盒是一款用于人源肺癌类器官原代提取、体外形成和扩增的试剂盒，包含从肺癌组织处理，到类器官构建、扩增及冻存的全套试剂。

使用说明

注意:以下操作均需在无菌环境中进行。

实验前准备:

(1)提前1 - 2小时从-20 °C冰箱取出所需体积的基质胶(产品目录号:PRS-LM ，PRECEDO )，于冰上融化。

(2)提前30分钟从4°C冰箱取出肺癌类器官培养基(产品目录号:PRS-LCM-3D，PRECEDO )，使其平衡至室温。

(3)将15 mL无菌离心管、无菌刀片、无菌枪头等表面消毒后放入超净工作台中紫外照射30分钟。

(4)配置含1%BSA(产品目录号:V900933，Sigma)的DMEM/F12培养基、含10%血清(产品目录号:10091148，Gibco)的DMEM/F12培养基，冰上预冷备用。

(5)配置含1%BSA(产品目录号:V900933， Sigma)的DMEM/F12冰上预冷备用。

肿瘤组织样本的消化:

(1)将样本倒入60mm培养皿中，吸干培养皿中的液体，随后加入5mL试剂盒内所含的组织清洗液(产品目录号: PRS-TCR-1，PRECEDO )，反复吹洗样本后吸出上清液，再加入1 mL清洗液在培养皿中，将组织切割大小 约为1～3mm(组织切割后呈“藕断丝连”状态)。

(2)加入5 mL清洗液，切割后的组织转移至15 mL离心管，1500 rpm 室温离心3 min;

(3)弃上清，加入6 mL消化酶稀释液(产品目录号:PRS-TDD-2，PRECEDO )和6 mL组织消化酶(产品 目录号:PRS-TDE-2，PRECEDO )，标记样本编号并封口，放入恒温振荡培养箱中消化，设置参数37°C、 250-300 rpm，间隔30 分钟观察消化是否完成(组织消化完成后应呈团絮状，没有明显肉眼可见硬块);此过程应 防止过度消化显著降低类器官的形成效率。

(4)将所得的细胞悬液用100 μm滤网过筛，用枪头研磨组织，使组织尽量通过筛网。1500 rpm，室温离心3分 钟，弃上清;

(5)若红细胞较多，添加3 mL红细胞裂解液，4°C裂解5 – 10 min。1500 rpm，离心5分钟，弃上清，用清洗液 重悬细胞沉淀待用。

肺癌类器官的培养(以24孔板为例)

(1)将获取的肺癌原代细胞悬液进行细胞计数，根据计数结果选择所需要接种的孔数(通常保证每孔至少含有 2×105个细胞)。

(2)1500 rpm，离心3 min，弃上清(此步骤可重复一次，以确保培养基完全去除)。将细胞沉淀置于冰上。

(3)从 37 °C 培养箱中取出 24孔板。用 DMEM/F12(含1% BSA)预冷200 μL枪头。按照40 μL/孔基质胶 的体积，将适量体积基质胶加入细胞沉淀，并在冰上小心吹打混匀(注意:为了避免气泡产生，在加入基质胶的时候 可按照损耗量多加入一些)。

(4)按照40 μL/孔基质胶的体积，将细胞沉淀与基质胶的混合悬液轻轻滴在已提前预热好的24孔板中央，使之形 成圆顶状胶滴。缓慢将细胞培养板移至培养箱，孵育至少30 min。

(5)待基质胶凝固后，沿24孔板内壁缓慢加入预先恢复至室温的肺癌类器官培养基(产品目录号: PRS-LCM-3D，PRECEDO )，置于5 % CO2、37 °C培养箱中培养。

(6)镜下观察类器官形成情况，每3 - 5天更换一次培养基。

肺癌类器官的传代(以24孔板为例，一般1 : 2传代)

(1)当培养板中类器官平均直径大于100μm，类器官细胞过多、生长超出胶体产生贴壁现象时需要传代。

(2)按照“实验前准备”部分准备好所需试剂及耗材，准备好类器官回收试剂(产品目录号:354253，Corn- ing)和类器官解离试剂(产品目录号:PRS-ODR，PRECEDO );

(3)将培养板中培养基吸入15 mL离心管，加入1 mL预冷的DMEM/F12培养基吹打底部胶体(轻柔，多次，把胶 吹散)，将吹散的胶体转入离心管。1500 rpm，室温离心5 min，弃上清。

(4)加入预冷的类器官回收试剂(产品目录号:354253，Corning)，一般1孔类器官需加入500μL，以此类 推。轻轻重悬细胞沉淀，冰浴30min后，300g，4 °C离心5min，弃上清;

(5)除胶完成后，1500rpm，4°C离心5min，弃上清，加入4mL类器官解离试剂(产品目录号:PRS-ODR，PRECEDO )，摇床转速250rpm，消化7-10min。

(6)摇床振荡完毕后，加入mL DMEM(含10% FBS)，300g，离心5min，吸弃上清，将细胞沉淀置于冰上。 按照“肺癌类器官培养”步骤的3-6继续进行类器官的接种和培养。

2胃癌类器官的冻存

(1)重复“肺癌类器官的传代”的步骤1 - 6;

(2)加入适量的类器官冻存液(产品目录号:PRS-OCR，PRECEDO 昇)于离心管中，轻柔混匀，制成混合 液。

(3)将离心管中的混合液分装于冻存管中，作好标记，建议每管体积1.5mL。

将标记好的细胞冻存管放入梯度冻存盒中，-80°C超低温冰箱中保存。注意:-80°C不可保存超过1周，若需长期 保存，需移至液氨罐中。

注意事项

1、本产品在使用前需平衡至室温。

2、使用产品时应注意无菌操作，避免污染。

3、本品含抗生素，如无特殊需要，可直接使用，无需任何添加。 3、为保持本产品的最佳使用效果，不宜将其过夜放置于室温或较高的温度环境中。

4、为达到预期效果，请于保质期内使用本产品。 

5、建议使用肿瘤术中样本，目的肿瘤细胞比例越高(至少>50%)，培养成功率越高。不推荐用于少量样本(如穿刺或者循环肿瘤细胞)的 培养。

6、本产品仅用于科研用途，不能用于体外诊断。

PS 本产品由ZWK、PRECEDO 联合提供技术支持。